武汉市“瘦肉精”酶联免疫吸附测定法检测程序

           为加强畜禽产品安全监督管理，保证畜禽产品质量，维护消费者权益，本着“公平、公开、公正”的原则，特制定《武汉市“瘦肉精” 酶联免疫吸附测定法检测程序》。
 　　一、方法提要或原理
测定的基础为抗原抗体反应。酶联板包被有克伦特罗特异性抗体的抗体，加入抗克伦特罗特异性抗体，两者结合被固定。标样或试样中克伦特罗与酶（辣根过氧化物酶）标记抗原竞争抗克伦特罗特异性抗体。通过洗涤以除去没有与抗克伦特罗特异性抗体结合的酶标记抗原，加入底物和发色剂，结合到酶联板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。在450nm处测定吸光度值，吸光度值与样品中的克伦特罗浓度成反比。
     二、测定方法
    1、尿液的测定方法：
使用前将试剂盒放置室温（19—25℃）1—2h。按每个标准溶液和试料做两个或两个以上平行实验计算所需酶联板条的数量，插入框架。向微孔中加入100μl用缓冲液稀释的抗体，用封口膜封好，室温孵育15min。倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，加水到酶联板的微孔内，倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复操作两次。精密吸取20μl标准溶液或试料至微孔中，并在每孔内加入100μl用缓冲液稀释的酶结合物，在微型震荡器上混匀，用封口膜封好，室温孵育30min。倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，加水到酶联板的微孔内，倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复操作两次。每孔加50μl底物缓冲液和50μl发色剂，在微型震荡器上充分混匀（也可先将底物和发色剂混匀，每孔加100μl），室温避光孵育15min。每孔加入100μl终止液，混匀。于450nm处测定吸光度值，60min内完成读数。
    2、动物组织的测定方法：
    （1）5g粉碎的样品与25mL 50mmol/L HCL混合，振荡1.5小时，以达到均质的目的。（2）称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中。（3）离心15分钟/4000g或更高的转速，在10—15℃。（4）转移上清液到另一个离心瓶中，加300μl 1 mol/L氢氧化钠混合15分钟。（5）加入4mL 500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（PH 3.0），简单的混合并在4℃保存至少1.5小时或过夜。（6）离心15分钟/4000g或更高的转速，在10—15℃，分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要）。（7）以下操作按尿液的测定方法进行。