H9 亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法(GB/T 19438.4—2004)

文号：GB/T 19438.4—2004
1 范围
本标准规定了荧光RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒的操作方法。
本标准适用于活禽及其产品中H9亚型禽流感病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的
修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法
3 缩略语
下列缩略语适用于本标准：
荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。
Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
RNA 核糖核酸。
DEPC 焦碳酸乙二酯。
PBS 磷酸盐缓冲盐水（配方见附录 A）。
Taq酶 Taq DNA聚合酶。
4 原理
H9 亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法是采用 TaqMan 技术。设计一对仅在 H9 亚型禽流感病毒
血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的 5’端和 3’端分别标记不同的
荧光素，如 5’端标记 FAM 荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用 R 表示），
3’端一般标记 TAMRA 荧光素，它在近距离内能吸收 5’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光
基团（用 Q 表示）。
当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧
光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶在引物
的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链；当链的延伸进行到探针
结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能，将探针切
成单核苷酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被
检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继
续检测到R所发出的荧光信号。
5 材料与试剂
5.1 试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处
理后高压灭菌）分装。
氯仿
异丙醇（-20 C 预冷） o
PBS：121±2 ℃，15 min 高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各 10 000 U/mL
75%乙醇:用新开启的无水乙醇和无 RNA 酶的水配制（符合 GB 6682－92 要求），-20 C 预冷 o
H9 亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测试剂盒 :组成、说明及使用注意事项见附录 A 1）
5.2 仪器与器材
荧光RT-PCR检测仪
高速台式冷冻离心机（最高转速12 000 r/min以上）
台式离心机（最高转速2 000 r/min）
混匀器
冰箱(2 C～8 C和-20 C两种)
o o o
可移动紫外灯
微量可调移液器及配套带滤芯吸头（10 μL、100 μL、1 000 μL）
专用毛细玻璃管或PCR管
Eppendorf管（1.5 mL）
6 抽样
6.1 采样工具
下列采样工具必须经（121±2） C，15 min高压灭菌并烘干： o
棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5 mL Eppendorf 管、研钵。
6.2 样品采集
6.2.1 活禽
取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：
——取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3次～5次取咽喉分泌液；
——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；
——将同一样品的咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有1.0 mL PBS的1.5 mL Eppendorf管中，加盖、
编号。
6.2.2 肌肉或组织脏器
待检样品装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号，送实验室。
6.2.3 血清、血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。
6.3 样品储运
样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱
中加冰、密封，送实验室。
6.4 样品制备
6.4.1 咽喉、泄殖腔拭子
样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转
入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。
6.4.2 肌肉或组织脏器
取待检样品2.0 g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL PBS混匀，4 C，3 000 r/min o
离心15 min取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。
6.5 样本存放
1） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同
的效果，则可使用这些等效产品。
样本在2 C～8 C条件下保存应不超过24 h，若需长期保存应放在-70 C以下冰箱，但应避免反复冻
o o o
融（冻融不超过3次）。
7 操作方法
7.1 实验室的设置与管理
实验室的设置与管理见GB/T 19438.1-2004附录C。
7.2 样本的处理
在样本制备区进行。
7.2.1取 n 个灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 为被检样品、阳性样品与阴性样品的和（阳性样品、
阴性样品在试剂盒中已标出），做标记。
7.2.2每管加入 600 μL 裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各 200 μL，一份样本换用
一个吸头，再加入 200 μL 氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手
颠倒混匀）。于 4 C、12 000 r/min 离心 15 min。
o
7.2.3取与 6.2.1 相同数量灭菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 μL 异丙醇（-20 C 预冷），做标记。 o
吸取本标准 6.2.2 各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取 500μL，不能吸出中间层，颠
倒混匀。
7.2.4于 4 C、12 000 r/min 离心 15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去
o
上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入 600 μL 75％乙醇，颠倒
洗涤。
7.2.5于 4 C、12 000 r/min 离心 10 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去
o
上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。
7.2.64 000 g 离心 10 s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到
管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，
室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。
7.2.7加入 11 μL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备用。提
取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需长期保存须放置于-70 C 冰箱。 o
7.3 检测
7.3.1扩增试剂准备
在反应混合物配制区进行。
从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2 000 r/min离心5 s。设所需
荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和，每个样品测试反应体系配制
见下表。
每个样品测试反应体系配制表
试剂 RT-PCR 反应液 Taq 酶
用量 15 μL 0.25 μL
根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，按每4份样品加入1颗RT-PCR
反转录酶颗粒，计算应加入的酶颗粒数，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装15 μL反应混合
物液体，转移至样本处理区。
7.3.2加样
在样本处理区进行。
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤7.1.7中制备的RNA溶液各10 μL，盖紧管
盖，500 r/min离心30 s。
7.3.3荧光 RT-PCR 检测
在检测区进行。
将本标准7.2.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：
第一阶段，反转录42 C /30 min；
o
第二阶段，预变性92 C/3 min；o
第三阶段，92 C/10s，45 C/30s，72 C/1min，5个循环；
o o o
第四阶段，92 C/10s，60 C/30s，40个循环，在第四阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。
o o
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
8 结果判定
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩
增曲线的最高点为准。
8.2 质控标准
8.2.1 阴性样品无 Ct 值或无扩增曲线。
8.2.2 阳性对照的 Ct 值应<28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
8.3 结果描述及判定
8.3.1 阴性
无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无H9亚型禽流感病毒。
8.3.2 阳性
Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在H9亚型禽流感病毒。
8.3.3 有效原则
Ct>30的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。