H7 亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法(GB/T 19438.3—2004)

文号：GB/T 19438.3—2004
1 范围
本标准规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法。
本标准适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的
修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法
3 缩略语
下列缩略语适用于本标准：
荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链式反应。
Ct 值 Cycle threshold，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
RNA Ribonucleic acid，核糖核酸。
Taq 酶 Taq DNA 聚合酶。
PBS 磷酸盐缓冲盐水。
DEPC 焦碳酸乙二酯。
4 原理
采用TaqMan方法，通过比对禽流感病毒血凝素基因，设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基因间
保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5’
端标记FAM荧光素为报告荧光基团（R），3’端标记的TAMRA荧光素（Q）在近距离内能吸收5’端荧光基团
发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。反应在退火时，引物和探针同时与目的基因片段结合，探针上R
基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥
5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而
被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。
5 试剂和材料
5.1 试剂
除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器进行分装。
H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒1 ：试剂盒的组成、说明及使用注意事项见本标准附录A。 ）
氯仿。
异丙醇。
75%乙醇，用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水（符合GB 6682-92要求）配制。
0.01 M (pH7.2)的 PBS：配方见 GB/T 19438.4-2004 附录 A。121 ℃±2 ℃，15 min 高压灭菌后，
1） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相
同的效果，则可使用这些等效产品。
无菌条件下按 10 000 U/mL 加入青霉素和链霉素。
5.2 仪器设备
高速台式冷冻离心机：要求最大离心力在12 000 g以上。
荧光PCR仪。
计算机。
2 ℃～8 ℃冰箱。
-20 ℃冰箱。
微量加样器（0.5 μL～10 μL；5 μL～20 μL；20 μL～200 μL；200 μL～1 000 μL）。
混匀器。
可移动紫外灯：要求近工作台面。
6 样品的采集与前处理
采样过程中样本间不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。
6.1 取样工具
需要下列取样工具：
——棉拭子；
——剪刀、镊子；
——Eppendorf 管；
——研钵。
以上取样工具必须经 121 ℃±2 ℃，15 min 高压灭菌并烘干。
6.2 采样方法
6.2.1 活禽样品
取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法为：
——对于咽喉拭子，采取时要深入喉头及上颚裂来回刮 3 次～5 次取咽喉分泌液；
——取泄殖腔拭子时，将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便；
——将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有 l.0 mL PBS 的 Eppendorf 管中备用。
6.2.2 肌肉或脏器样品
用无菌的剪刀、镊子取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨，加10 mL PBS混匀，1 000 g离心10 min
后，取上清液转入Eppendorf管中备用。
6.2.3 血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至Eppendorf管内备用。
6.2.4 保存与运送
采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h，长期保存须在-70 ℃以下，但应避免反
复冻融(冻融不超过3次)。
样品采集后，将采集的样品密封并编号，采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。
7 操作方法
7.1 实验室的设置与管理
实验室的设置与管理见GB/T 19438.1-2004附录C。
7.2 样本的制备
7.2.1 在样本制备区进行。
7.2.2 样本的制备程序
7.2.2.1取 n 个 1.5 mL 灭菌 Eppendorf 管，其中ｎ为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，
对每个管编号标记；
7.2.2.2 每管加入 600 μL 裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各 200 μL ，一份样
本换用一个吸头；再加入 200 μL 氯仿，混匀器上剧烈震荡混匀 5 s。于 4 ℃条件下，12 000 g 离心
15 min；
7.2.2.3取与本标准 7.2.2.1 中相同数量的 1.5 mL 灭菌 Eppendorf 管，加入 500 μL 异丙醇(－20 ℃
预冷)，对每个管编号标记；
7.2.2.4 吸取本标准 7.2.2.2 离心后各管中的上清液转移至已加入异丙醇的相应管中，上清液至少吸
取 500 μL，不要吸出中间层，颠倒混匀；
7.2.2.5 于 4 ℃条件下，12 000 g 离心 15 min ，注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转
轴方向放置。轻轻倾去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品须在吸水纸不同地方沾干；
7.2.2.6 加入 600 μL 75％乙醇，颠倒洗涤。于 4 ℃条件下，12 000 g 离心 15 min。轻轻倾去上清
液，倒置于吸水纸上，沾干液体；
7.2.2.7 4 000 g 离心 lO s 将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器将其吸干，一份样本换用
一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min。不宜过于干燥，以免 RNA 不溶；
7.2.2.8 加入 11 μL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000g 离心 5 s，冰上保存备用。提取
的 RNA 须在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增，长时间保存，须置于-70 ℃条件下。
7.3 靶核酸的反转录和扩增
7.3.1 扩增试剂准备与配制
7.3.1.1 在反应混合物配制区进行。
7.3.1.2 从试剂盒中取出相应的 RT－PCR 反应液、Taq 酶，待反应液室温下融化后，2 000 g 离心 5 s。
设所需 PCR 反应数为 n，其中ｎ为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系
需使用 15 μL RT-PCR 反应液及 0.25 μL Taq 酶。计算各试剂的使用量，加入一试管中，向其中加入 0.25
×n 颗 RT-PCR 酶颗粒，充分混合均匀，向每个 PCR 管中各分装 15 μL，转移至样本处理区。
7.3.2 加样
7.3.2.1 在样本处理区进行。
7.3.2.2 在各设定的 PCR 管中分别加入本标准 7.2.2.8 制备的 RNA 溶液各 lO μL，盖紧管盖后，500 g
离心 30 s。
7.3.3 荧光 RT—PCR 反应
7.3.3.1 在检测区进行。
7.3.3.2 将本标准 7.3.2.2 中加样后的 PCR 管放入荧光 PCR 检测仪内并记录样本摆放顺序。
7.3.4 反应参数设置
荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的反应参数为：
——第一阶段，反转录 42 ℃/30 min；
——第二阶段，预变性 92 ℃/3 min；
——第三阶段，92 ℃/10 s，45 ℃/30 s，72 ℃/1 min，5 个循环；
——第四阶段，92 ℃/10 s，60 ℃/30 s，40 个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火
延伸时进行。
8 结果判定
8.1 结果分析条件设定
8.1.1 读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
8.1.2 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
8.2 质控标准
阴性对照的检测结果应没有特异性扩增，阳性对照的Ct值应＜28.0。
8.3 结果描述及判定
8.3.1阳性
Ct值≤30，而且出现明显的扩增线，表明样品中存在H7亚型禽流感病毒。
8.3.2阴性
无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无H7亚型禽流感病毒。
8.4 有效原则
Ct值＞30.0的样本须重做，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。