1 范围
本标准规定了H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。
本标准适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的
修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒型通用型荧光RT-PCR检测方法
3 缩略语
下列缩略语适用于本标准：
荧光RT-PCR 荧光反转录—聚合酶链反应。
Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
RNA 核糖核酸。
Taq酶 Taq DNA 聚合酶
PBS 磷酸盐缓冲生理盐水
DEPC 焦碳酸乙二酯
4 原理
采用TaqMan方法，在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上，设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血凝
素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段内
部。其中5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q
表示），它在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与
目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应
进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，
所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，
荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
5 试剂和材料
5.1 试剂
除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。
氯仿
异丙醇：-20 ℃预冷
75 %乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB6682要求）配制，-20 ℃预冷
0.01 mol/L（pH 7.2）的PBS：配方见GB/T 19438.4-2004附录A。121±2 ℃，15 min高压灭菌冷却
后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10 000 U/mL。
H5 亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒1 ：试剂盒的组成、说明及使用注意事项见本标准附录A。 ）
5.2 仪器设备
5.2.1 高速台式冷冻离心机
最大离心力 12 000 g 以上。
5.2.2 荧光 PCR 检测仪、计算机
5.2.3 2～4 ℃冰箱和-20 ℃冰箱
5.2.4 微量加样器
0.5 μL～10 μL，5 μL～20 μL，20 μL～200 μL，200 μL～1 000 μL。
5.2.5 组织匀浆器
5.2.6 混匀器
5.2.7 可移动紫外灯
6 样品的采集与前处理
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。
6.1 取样工具
下列取样工具必须经121±2 ℃，15 min高压灭菌或经160 ℃干烤2 h。
拭子；
剪、镊；
研钵；
Eppendorf管（1.5 mL）。
6.2 采样方法
6.2.1 活禽样品
取咽喉拭子和泄殖腔拭子，具体采集方法如下：
咽喉拭子，采取时要将拭子深入喉头及上腭裂来回刮3～5次，取咽喉分泌液；
取泄殖腔拭子时，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便；
将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1.0 mL PBS的Eppendorf管中，编号备用。
6.2.2 内脏或肌肉样品
用无菌镊剪夹取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨，再加10 mL PBS混匀，或置于组织匀浆器中，加
入10 mL PBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中3 000 r/min离心10 min，取上清液转入
Eppendorf管中，编号备用。
6.2.3 血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。
6.3 存放与运送
采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃冰箱，但
应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实
验室。
7 操作方法
7.1 实验室的设置与管理
实验室的设置与管理见GB/T 19438.1-2004附录C。
7.2 样本的处理
在样本处理区进行。
1) 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同
的效果，则可使用这些等效产品。
7.2.1 取 n 个 1.5 mL 灭菌 Eppendorf 管，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，
对每个管进行编号。
7.2.2 每管加入 600 μL 裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各 200 μL，吸头反复
吸打混匀（一份样本换用一个吸头）；再加入 200 μL 氯仿，混匀器上震荡混匀 5 s（不宜过于强烈，
以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。于 4 ℃条件下，12 000 r/min 离心 15 min。
7.2.3 取与本标准 7.2.1 中相同数量的 1.5 mL 灭菌 Eppendorf 管，加入 400 μL 异丙醇（-20 ℃ 预
冷），对每个管进行编号。吸取本标准 7.2.2 离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸
取 500 μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。
7.2.4 12 000 r/min 离心 15 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，
倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。加入 600 μL 75%乙醇，颠倒洗涤。
7.2.5于 4 ℃条件下，12 000 r/min 离心 10 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置）。
轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。
7.2.6 4 000 r/min 离心 10 s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液
体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温
干燥 3 min。不宜过于干燥，以免 RNA 不溶。
7.2.7 加入 11 μL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备用。
提取的 RNA 须在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增或放置于 -70 ℃冰箱。
7.3 扩增试剂准备与配置
在反应混合物配制区进行。
从试剂盒中取出AIV H5亚型RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2 000 r/min离心5 s。设所
需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，每个样本测试反应体系配制见
下表。
表 测试反应体系配制表
试剂 RT-PCR 反应液 Taq 酶
用量 15 μL 0.25 μL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入0.25× n颗RT-PCR酶颗粒，充分混合
均匀，向每个PCR管中各分装15 μL，转移至样本处理区。
7.4 加样
在样本处理区进行。在各设定的 PCR 管中分别加入本标准 7.2.7 中制备的 RNA 溶液各 10μL，盖紧
管盖后，500 r/min 离心 30 s。
7.5 荧光 RT-PCR 反应
在检测区进行。将本标准 7.4 中加样后的 PCR 管放入荧光 PCR 检测仪内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置
荧光 RT-PCR 检测 H5 亚型禽流感病毒的反应参数为：
——第一阶段，反转录 42 ℃/30 min；
——第二阶段，预变性 92 ℃/3 min；
——第三阶段，92 ℃/10 s，45 ℃/30 s，72 ℃/1 min，5 个循环；
——第四阶段，92 ℃/10 s，60 ℃/30 s，40 个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火
延伸时进行。
8 结果判定
8.1 结果分析条件设定
读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性
为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。
8.2 质控标准
8.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。
8.2.2 阳性对照的 Ct 值应＜28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
8.3 结果描述及判定
8.3.1 阴性
无 Ct 值并且无扩增曲线，表示样品中无禽流感病毒。
8.3.2 阳性
Ct 值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样本中存在禽流感病毒。
8.3.3 有效原则
Ct 值＞30.0 的样本须重做。重做结果无 Ct 值者为阴性，否则为阳性。